基于核酸的分子生物學(xué)檢測方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR），能夠用于精準(zhǔn)地分析樣本中微生物的種類和豐度，但是難以區(qū)分微生物的存活狀態(tài)。傳統(tǒng)的用于檢測樣本中活細(xì)胞的方法都需要對樣本進(jìn)行培養(yǎng)，但是此類檢測方法存在一定的局限性，無法用于檢測一些難培養(yǎng)或是不可培養(yǎng)的活細(xì)胞。疊氮溴化丙錠（Propidium monoazide，PMA）是一種能與DNA結(jié)合的光反應(yīng)染料，不具有細(xì)胞膜滲透性，無法穿透活細(xì)胞完整的細(xì)胞膜，只能選擇性地穿透死細(xì)胞受損的細(xì)胞膜。進(jìn)入細(xì)胞后，PMA會(huì)與DNA雙螺旋發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，進(jìn)而阻礙死細(xì)胞中目標(biāo)DNA的PCR擴(kuò)增，如圖1所示?；赑MA的這一特性，通過對PMA處理過的樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序分析，即可得知樣本中微生物的存活狀態(tài)。

現(xiàn)在已經(jīng)有越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道采用了PMA-PCR或PMA-qPCR等方法對樣本中的活細(xì)胞進(jìn)行定性或定量分析，下面解讀三篇文獻(xiàn)。

(相關(guān)資料圖)

文獻(xiàn)一：Andreas N, Katherine ES, Anne KC. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods, 2007, Volume 70, Issue 2.

文章采用了PMA-qPCR的方法，對四種常用的滅菌方法進(jìn)行了效率評估。作者選擇了鼠傷寒沙門氏桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、大腸桿菌和鳥分枝桿菌這四種常見的致病菌，分別采用次氯酸鹽、苯扎氯銨、紫外線和加熱消毒法進(jìn)行滅菌處理，并用PMA進(jìn)行交聯(lián)處理。將處理好的樣本和未經(jīng)處理的對照樣本一起進(jìn)行基因組抽提，并分別用四株菌的特異引物對樣本進(jìn)行qPCR定量分析。作者還同時(shí)對樣本進(jìn)行了平板培養(yǎng)，作為PMA處理效果的對照實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，次氯酸鹽、苯扎氯銨和加熱消毒法的滅菌效果都符合預(yù)期，PMA-qPCR和平板培養(yǎng)的結(jié)果基本一致，部分結(jié)果如下圖1所示。而紫外線處理的樣本經(jīng)過PMA處理后，qPCR定量結(jié)果與未處理對照組的基本一致，如下圖2所示，且PMA-qPCR的結(jié)果與平板培養(yǎng)的結(jié)果之間存在較大的差異，其原因可能是紫外線的滅菌原理是破壞微生物的DNA而非細(xì)胞膜，這導(dǎo)致了PMA無法與死細(xì)胞的DNA進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)，只有用紫外線進(jìn)行長時(shí)間的照射處理才能破壞細(xì)胞膜。

圖1不同濃度的次氯酸鹽對沙門氏菌的滅菌效果。（A）平板計(jì)數(shù)的結(jié)果，橫坐標(biāo)表示次氯酸鹽濃度，C為未處理對照。（B）PMA處理后將菌體轉(zhuǎn)移至裂解抽提管中。（C）PMA處理（+）和未處理對照組（-）基因組的凝膠電泳圖。（D）qPCR定量結(jié)果，縱坐標(biāo)為未處理對照組和PMA處理組的Ct值差。

圖2.不同時(shí)長的紫外線處理對大腸桿菌的滅菌效果。（A）PMA處理和未處理對照組的qPCR定量結(jié)果，橫坐標(biāo)代表紫外線處理時(shí)長，縱坐標(biāo)為Ct值。（B）PMA處理（+）和未處理對照組（-）基因組的凝膠電泳圖。

文獻(xiàn)二：Jialing N, Shingo H, Yin W, et al. Uncovering Viable Microbiome in Anaerobic Sludge Digesters by Propidium Monoazide (PMA)-PCR. Microbial Ecology, 2019, Volume 79.

厭氧消化是一種非常高效的污水處理方法，若想維持厭氧消化池的正常運(yùn)作，就必須首先了解參與消化的微生物種群。本文的作者從多個(gè)污水廠采集了污泥樣本，分別做了PMA處理和不處理的對照，并進(jìn)行基因組抽提、16S V3-V4高通量測序和qPCR定量分析。

根據(jù)qPCR定量的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)用PMA處理過的樣本中16S拷貝數(shù)少于未處理過的樣本，說明在樣本中約有10%的死細(xì)胞。對高通量結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)用PMA處理過的樣本中微生物的種類和多樣性要明顯少于未處理過的對照樣本，如下圖1所示，部分細(xì)菌在經(jīng)過PMA處理后相對豐度降低了約90%，如α-變形菌和β-變形菌，這些微生物可以被視為污水處理過程中的殘留物；而有些細(xì)菌的相對豐度則升高了，如擬桿菌門、綠彎菌門和厚壁菌門的微生物，具體可見下圖2。在所有用PMA處理過的樣本中，廣古菌門、擬桿菌門、δ-變形菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、WWE1、螺旋體門、互養(yǎng)菌門和Caldiserica門的微生物占了大多數(shù)。

文獻(xiàn)三：Lanxin M, Jie Y, Hao J, et al. Investigating the bacterial microbiota of traditional fermented dairy products using propidium monoazide with single-molecule real-time sequencing. Journal of Dairy Science, 2019, Volume 102, Issue 5.

乳制品在游牧民族中是一類頗受歡迎的食品，而發(fā)酵類乳制品中的微生物，尤其是乳酸菌，能夠提高乳制品的外觀和口感。過去對于乳制品中微生物的鑒定往往采用培養(yǎng)法，但是此方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對于一些苛養(yǎng)菌（fastidious microbes）的檢測效果也不是很理想。本文的作者對多種傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品進(jìn)行了采樣，使用PMA與三代測序結(jié)合的方法，對樣本中的活菌和死菌分別進(jìn)行了分析。作者同時(shí)還采用了傳統(tǒng)的培養(yǎng)法對樣本中的微生物進(jìn)行分離和鑒定。

分析測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌的相對豐度在所有樣本中都是最高的。部分樣本在經(jīng)過PMA處理后，乳酸桿菌的相對豐度都有所提高，鏈球菌的相對豐度則有所下降；另外一些樣本中則是腸桿菌的相對豐度提高了，而乳酸桿菌的相對豐度發(fā)生了下降，具體可參考下圖1。對比PMA處理的結(jié)果和傳統(tǒng)培養(yǎng)法的結(jié)果，作者發(fā)現(xiàn)使用PMA處理的方法可以檢測到一些使用培養(yǎng)法檢測不到的痕量微生物，如清酒乳桿菌和腸膜明串珠菌。

微基生物現(xiàn)在也開發(fā)出了一套對樣本進(jìn)行PMA處理和高通量/qPCR定量分析的系統(tǒng)，能夠?qū)颖局械幕罹M(jìn)行較為精準(zhǔn)地定性和定量分析。